Terapia epigenómica en la Neumonía

Tema: La inhibición de las desacetilasas de histonas protege a los ratones sépticos de la apoptosis pulmonar y esplénica.

Mecanismo epigenómico tratado : Inhibición de las desacetilasas de histonas

¿Cómo se lo hizo?

Examinamos si la histona desacetilasa (HDAC) puede contribuir a la inflamación asociada a la sepsis y la apoptosis.

La sepsis polimicrobiana fue inducida por la ligadura y punción cecal (CLP) en ratones BALB / c. Se administró una inyección intraperitoneal de CG200745 (10 mg / kg), un nuevo inhibidor de HDAC de amplio espectro, o ácido valproico (500 mg / kg), un inhibidor predominante de HDAC de clase I, 3 h antes de la cirugía.

Resultados:

• Los niveles de proteína HDAC1, HDAC2 y HDAC3 disminuyeron en los pulmones después de CLP.
• La sepsis inducida por CLP aumentó los niveles de acetilación de histonas H3 y H4 en los pulmones.
• Cuando se administró CG200745, la inducción de apoptosis fue fuertemente suprimida en pulmones y bazos de ratones sépticos.
• Este efecto antiapoptótico de CG200745 no estuvo acompañado por una regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas y negativas de las proteínas proapoptóticas de los miembros de la familia Bcl-2
• El tratamiento con CG200745 no logró inhibir los niveles elevados de citocinas séricas y evitar la inflamación pulmonar en ratones sépticos
• El ácido valproico también mostró efectos antiapoptóticos pero no antiinflamatorios en ratones sépticos.

Referencias Bibliográficas: 

1. Takebe M, Oishi H, Taguchi K, Aoki Y, Takashina M, Tomita K et al. Inhibition of histone deacetylases protects septic mice from lung and splenic apoptosis. Pub Med US National Library of Medicine National Institutes of Health [Internet]. 2014 [cited 11 January 2020];. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24290430

Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en Neumonía

Transferencia mediada por adenovirus del grupo hemo oxigenasa-1 ADNc atenúa la lesión pulmonar grave inducida por el virus de la gripe en ratones

Tipo de edición: In vivo, somática

Dirigido hacia: ADNc de hemo oxigenasa-1.

Dirigido por: Adenovirus

Organo a tratar: Pulmón

Via de administración:Inhalación 

Resultados: 

Corto plazo 

Demostraron mediante el uso de proin- relativamente simple

estímulos inflamatorios (LPS, hiperoxia, peróxido de hidrógeno,

TNF) son consistentes con el concepto de que HO-1 excesiva

expresión tiene la capacidad de atenuar la lesión pulmonar

inducida por una variedad de patógenos en el aire por modulada

ING citoquinas perfiles de expresión a través de un cambio en el

actividad p38MAPK, por la disminución de células inflamatorias

migraciones en el pulmón, o por la supresión de apoptosis

muerte de las células epiteliales respiratorias inducidas por reactiva

especies de oxígeno.

Mediano plazo 

Los datos demuestran que la pre-administración de Ad.HO-1

migración atenuada de células inflamatorias en el pulmón

después de la inoculación H1N1, disminución patológica

cambios y el aumento de la supervivencia de los animales de prueba

Largo plazo

 La administración Ad.HO-1 proinflamatoria no sólo significativamente modulada abajo

la producción de citoquinas evocado por la administración de Ad

partículas de vectores, sino que también atenúan la DNA de fragmentación

de las células epiteliales respiratorias y la activación de la

caspasa inducida por el H1N1

HO-1 exógena transferencia de genes podría ser un potencial tera-

péutico enfoque para el tratamiento de la lesión pulmonar aguda inducida por

virus u otros microorganismos tales como las bacterias

Pneumocystis carinii.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. T Hashiba, M Suzuki, Y Nagashima, S Suzuki, S Inoue, T Tsuburai et al. Adenovirus-mediated transfer of heme oxygenase-1 cDNA attenuates severe lung injury induced by the influenza virus in mice [Internet]. Nature.com. 2010 [cited 3 January 2020]. Available from: https://www.nature.com/articles/3301540.pdf

Terapia con stem cells en Neumonía

Tema: Las células madre mesenquimales mejoran la supervivencia y el aclaramiento de bacterias en murino Escherichia coli neumonía

Tipo de Stem Cells: Células madre mesenquimales (MSCs) singénicas de ratones (médula ósea) 

Método de obtención : kits de ELISA (R&D)

Resultados: 

El tratamiento con MSC mejoran la supervivencia y el fenotipo de la E coli.

MSC reducen la gravedad de la lesión pulmonar en el E coli 

El bloqueo de la lipocalina 2 inhibe la actividad antibacteriana in vivo en de MSCs.

Co-cultivo de MSCs estimuladas con LPS y los macrófagos alveolares aumenta la producción de lipocalina 2

Referencias bibliográficas

• Gupta N, Mouded M, Tan X. Las células madre mesenquimales mejoran la supervivencia y el aclaramiento de bacterias en murino Escherichia coli neumonía. 2012 (actualizado en 2012; acceso el 08 de Junio de 2017) Disponible en: http://thorax.bmj.com/content/67/6/533

Transgénico animal en la Neumonía

Un grupo de científicos españoles, del Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) de Madrid, ha desarrollado ratones transgénicos que permitirán estudiar los efectos de virus como el de la neumonía atípica o SRAS (Síndrome Respiratorio Agudo Severo) y experimentar nuevas vacunas. Las conclusiones del estudio se publican en la edición digital de la revista Proceedings of the National Academy of Sciences.

• Ventajas  

1. Permite desarrollar vacunas frente a distintos agentes infectivos, particularmente aquellos que nos invaden por las mucosas respiratorias o entéricas, que son los más abundantes. 
2. Estudiar los efectos de virus como el de la neumonía atípica o SRAS (Síndrome Respiratorio Agudo Severo). 
3. Este modelo animal también permite evaluar la eficacia y bioseguridad de un vector para vacunas y terapia génica.
4. Pueden ser resistentes a enfermedades causadas por virus, hongos y bacterias.
5. Se puede hacer experimentación que no implique a personas, mientras que las vacunas se consideren eficaces y seguras.

• Desventajas

1. Estos genes alterados podrían crear alérgenos adicionales o tener otros efectos desconocidos en los humanos.
2. La aplicación masiva de transgénicos en los cultivos produce una amenaza para la biodiversidad que de por si misma se encuentra disminuida
3. Resultados no esperados pueden aparecer, los científicos hicieron que los ratones expresaran el receptor para el virus humano, lo cual no fue suficiente.
4. Siempre puede haber un rechazo frente al gen extraño.
5. En el caso de alimentos transgénicos  no se sabe cómo afectará a la larga a la salud humana en nuestra dieta, ya que por ejemplo, algunos de estos genes introducidos en los alimentos tienen resistencia a determinados antibióticos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. El País. Investigadores españoles crean un ratón transgénico para estudiar la neumonía.[Internet].Madrid.[actualizado el 24 de mayo de 2005; acceso el 10 de diceimbre de 2016]. Disponible en: http://sociedad.elpais.com/sociedad/2005/05/24/actualidad/1116885606_850215.html

ADN recombinante artificial en Neumonía

Tema: FAMILIAS DE LA PROTEINA DE SUPERFICIE PspA DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. RELACION CON SEROTIPOS Y LOCALIZACION

Objetivo: Identificar las familias de PspA de aislamientos de pacientes de nuestra región y relacionarlas con los serotipos prevalentes y patologías, con la posible obntención de una vacuna.

G: Gen PspA que codifica para la proteína que lleva el mismo nombre

ER:No especifica

EL:No especifica

V:No especifica

CR: Procariota

MTG: Transformación por conjugación

MIC: Cultivo, PCR : Determinar los genes PspA

          Electroforesis para proteínas .

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 

1. C.Mayoral, M.Bianca, M.Baroni, R.Giani, M.Regueira, F.Zalazar. Familias de la proteína de superficie PspA de Streptococcus pneumoniae. relación con serotipos y localización. Buenos Aires. (actualizado el 24 de junio de 2010, acceso el 13 de junio de 2015). Disponible en: http://www.scielo.org.ar/pdf/medba/v70n5/v70n5a07.pdf.

Recombinación de ácidos nucléicos que suceden en la naturaleza

Crossing Over

Un claro ejemplo de ADN recombinante naturaleza esta representado por el crossing over, este es un proceso de intercambio genético, que forma parte del proceso normal de la meiosis en la células reproductoras.

Proceso mediante el cual los cromosomas homólogos intercambian segmentos cromosómicos y por tanto material hereditario. El sobrecruzamiento ocurre en varias fases e implica la síntesis y reparación de ADN. Para que el sobrecruzamiento sea correcto ha de ocurrir que se rompan las cadenas de ADN por las mismas bases en cromátides de cromosomas homólogos y que la posterior unión se haga de cada segmento con su cromátide homólogo y no con el que pertenecía antes de la rotura. La recombinación genética resultante hace aumentar la variación genética entre la descendencia de progenitores que se reproducen por vía sexual.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 

1. Significado biológico de la meiosis [Internet]. Ucm.es. 2012 [cited 12 December 2019]. Available from: https://www.ucm.es/data/cont/media/www/pag-56185/16-La%20Meiosis.pdf
2. Qué Es El Crossing Over. Meiosis. Procesos biológicos [Internet]. 2018 [cited 12 December 2019]. Available from: https://es.scribd.com/document/373417280/Que-Es-El-Crossing-Over

RT-PCR cuantitativa específica y sensible de miRNAs con cebadores de ADN

La PCR cuantitativa de muestras biológicas se realizó en 10 μl de volumen total con 1 μl de ADNc diluido 8-10 veces, 5 μl de 2x mezcla maestra de PCR QuantiFast SYBR Green (Qiagen, Alemania), 250 nM de cada cebador o 2 μl microRNA LNATM cebador conjuntos (Exiqon, Dinamarca). Se realizaron curvas estándar con diluciones de 10 veces para todos los ensayos para calcular la eficiencia de qPCR.(1)

Se usaron las mismas condiciones de PCR para las plantillas sintéticas, excepto que se usó 1 μl de plantilla sintética en 2 ng / μl de ADN de esperma de salmón (Sigma, EE. UU.) En TE en lugar de ADNc. Se utilizó 2x Brilliant III Ultra-Fast QPCR Master Mix (Agilent, EE. UU.) 

Las condiciones de ciclismo fueron 95 ° C durante 5-10 min seguidas de 40 ciclos de 95 ° C durante 10-30 segundos y 60 ° C 30-60 segundos. Se realizó un análisis de la curva de fusión (60 ° C a 99 ° C) después del perfil térmico para garantizar la especificidad en la amplificación.

El QPCR de muestras biológicas se realizó en una máquina MX3000P (Stratagene, EE. UU.) Y las reacciones que contienen plantillas sintéticas se realizaron en un Rotorcycler (Qiagen, Alemania). Los cebadores enriquecidos con LNA fueron conjuntos de cebadores de microRNA LNA ™ PCR diseñados por Exiqon (Dinamarca)(1)

La cuantificación se basó en la determinación del ciclo de cuantificación (Cq) y la eficiencia de la PCR se calculó a partir de la porción logarítmica lineal de las curvas estándar(1)

Referencias Bibliográficas:

1. Balcells, I., Cirera, S. & Busk, P.K. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol 11, 70 (2011) doi:10.1186/1472-6750-11-70

MICRORRAY EN NEUMONÍA

Tema: Los pacientes intubados que presentan traqueobronquitis o neumonía tienen patrones distintivos de expresión genética del sistema del complemento en el período previo a la infección: un estudio piloto

Objetivo: Identificar y comparar la expresión de genes VAP / IVA “firmas” utilizando microarrays de ADN de todo el genoma.

Muestra: Secreciones traqueales, sangre

Tipo de ácido nucleico: ARN total

Extracción de ADN

Lisis: Sistema PAXgene Blood RNA 

Purificación: Sistema PAXgene Blood RNA 

Separación: Sistema PAXgene Blood RNA 

Genes a amplificar: Cyanine 3-CTP-cRNA marcado

Tipo de prueba: Microarrays de ADN

Visualización: Análisis IPA

Desnaturalización: GeneSpring GX 11.0

Hibridación: GeneSpring GX 11.0

Extensión: GeneSpring GX 11.0

Numero de ciclos: GeneSpring GX 11.0

Referencias Bibliográficas: 

1. Loeches, Papiio, Amansa. Intubated patients developing tracheobronchitis or pneumonia have distinctive complement system gene expression signatures in the pre-infection period: A pilot study [actualizada el 4 de Mayo de 2012, acceso el 20 de Mayo de 2017]. Disponible en: http://www.medintensiva.org/en/intubated-patients-developing-tracheobronchitis-or/articulo/S2173572712000768/

PCR en Neumonía

Tema: Detección por PCR múltiple de gérmenes atípicos en pacientes con neumonía adquirida de la comunidad

Objetivo: La detección simultánea, mediante métodos moleculares, a M. pneumoniae, C. pneumoniae y L. pneumophila en muestras respiratorias de pacientes con neumonía adquirida en la comunidad, y describir los gérmenes comunes aislados por métodos microbiológicos convencionales

Muestra: Esputo, secreción faríngea y lavado broncoalveolar 

Tipo de ácido nucleico: ADN bacteriano

Extracción de ADN:

• Lisis: Kit comercial Wizard Genomics
• Purificación: Kit comercial Wizard Genomics
• Separación: Kit comercial Wizard Genomics

Genes a amplificar: OMP o la proteína 60-kDa16S, rRNA.

Número de pares de bases: 352 pares de bases en M. pneumoniae, 333 pares de bases en C. pneumoniae y 233 pares de bases en L. pneumophila.

Tipo de PCR: PCR Múltiple

Visualización: Electroforesis

• Desnaturalización: Técnica de Mejuto y colaboradores
• Hibridación: 55°C y la Técnica de Mejuto y colaboradores
• Extensión: Técnica de Mejuto y colaboradores
• Numero de ciclos: Técnica de Mejuto y colaboradores

Referencias Bibliográficas:

1. Guillén R, Franco R, Franco L, Moraga P, Ojeda M, Russomando G. Detección por PCR múltiple de gérmenes atípicos en pacientes con neumonía adquirida de la comunidad que concurrieron al INERAM. Mem. Inst. Investig. Cienc. Salud [Internet]. 2012 June [cited 2019 Nov 15] ; 10( 1 ): 24-35. Available from: http://scielo.iics.una.py/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1812-95282012000100004&lng=en.

Prueba de tamizaje y confirmación para Neumonía Congénita

Prueba de tamizaje

Una prueba de tamizaje nos permite detectar una enfermedad rápidamente pero no establece un diagnóstico definitivo. La principal prueba de tamizaje para una neumonía es la radiografía de tórax.(1)

 

Prueba confirmatoria

Esta no permite llegar a un diagnóstico definitivo en la enfermedad.

Hemocultivo: Los principales agentes bacterianos que se asocian con la neumonía son Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, y Klebsiella pneumoniae. Al igual se puede realizar un cultivo de líquido pleural si hay presencia de rodeando a los pulmones, sería necesario confirmar la técnica más efectiva para realizarla en un bebé, ya sea en el momento de su nacimiento o tiempo antes de este.(2)(3)

Referencias Bibliográficas:

1. ESTEVAN M. Examen radiográfico del tórax en las neumonías de probable causa bacteriana [Internet]. Scielo.edu.uy. 2002 [cited 10 November 2019]. Available from: http://www.scielo.edu.uy/pdf/adp/v73n1/v73n1a04.pdf
2. Hemocultivos en niños con neumonía adquirida en comunidad - Artículos - IntraMed . Intramed.net. 2018 [cited 10 November 2019]. Available from: https://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoid=91713
3. Martínez Chamorro, MJ. Grupo de Patología Infecciosa AEPap. Diagnóstico de laboratorio de la enfermedad neumocócica: utilidad del test rápido de detección del antígeno neumocócico en orina en Pediatría. Febrero 2014. Disponible en http://www.aepap.org/grupos/grupo-de- patologiainfecciosa/contenido

Alteraciones de la Epigenómica de la Neumonía Congénita

La epigenómica es aquella que le da sentido a la expresión genética, una alteración en esta nos traerá consigo problemas en la expresión de los genes y estos cambios son transmitidos a sus células hijas.
Hemos encontrado varios fenómenos epigenéticos que aumentan el riesgo de neumonía, entre ellos están:

• Hábito de tabaquismo materno durante el embarazo que aumenta la posibilidad de que su hijo obtenga esta enfermedad, a  través de mecanismos epigenéticos. El estrés psicológico materno aumenta los niveles de IgE en el cordón umbilical. Es posible que este fenómeno se relacione con supresión de la producción de citoquinas Th-1 por trofoblastos de la placenta y con el desarrollo del sistema inmune.
• Contaminación del aire
• Infección por virus y bacterias en la madre

Los mecanismos epigenéticos como la metilación del DNA y la modificación de histonas (como la acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación), sirven como señales reconocidas por complejos que modifican la estructura de la cromatina, dando lugar a cromatina transcripcionalmente activa o no.

Referencias Bibliográficas:

1. Gavidia Tania. Pronczuk Jenny. Sly Peter. Impactos ambientales sobre la salud respiratoria de los niños. Carga global de las enfermedades respiratorias pediátricas ligada al ambiente. Scielo. Revista chilena de pediatría
2. Learn Genetics. Epigenetics & Inheritance. Genetic Science Learning Center . [actualizada en 2013, acceso el 29 de Abril de 2017].

Alteraciones en la traducción de la Neumonía Congénita

En cuanto  a las alteraciones que se pueden producir por la traducción del ADN en la Neumonía Congénita  destacamos las mutaciones que son los cambios en la secuencia de bases de ADN, que se pueden presentar tanto en regiones codificadas como en las no codificadas (principalmente en zonas próximas al sitio de corte y empalme que permite eliminar los intrones –spli- cing– y en zonas reguladoras que podrían afectar a la tasa de producción de proteínas).
Estas mutaciones pueden ser silenciosas y no tener efecto en la proteína resultante o involucrar enormes cambios.(1)

Referencias Bibliográficas: 

1. P.J. Romero Palacios, J.A. Lorente Acosta, J.C. Álvarez Merino, J.D. Luna del Castillo. Genética de las enfermedades respiratorias [Internet]. Neumosur.net. [cited 10 October 2019]. Available from: https://www.neumosur.net/files/EB04-16%20genetica.pdf

Alteraciones en la transcripción de la Neumonía Congénita

Uno de los errores más comunes cuando nos referimos a la transcripción del ADN son los polimorfismos. En este caso son variaciones normales en la secuencia del ADN, pero pueden afectar las características de un individuo tanto como las mutaciones. Podemos encontrar varios tipos de polimorfismos entre ellos: polimorfismos de longitud VNTRs y STRS hasta los polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs, todo esto provocando cambios característicos y llevando consigo a enfermedades respiratorias en este caso Neumonía Congénita. (1)

Referencias Bibliográficas:

1. P.J. Romero Palacios, J.A. Lorente Acosta, J.C. Álvarez Merino, J.D. Luna del Castillo. Genética de las enfermedades respiratorias [Internet]. Neumosur.net. [cited 10 October 2019]. Available from: https://www.neumosur.net/files/EB04-16%20genetica.pdf